Kali Linux 64 bit Virtual Box - это фактически предварительно сконфигурированный файл Virtual Box. Kali Linux 2016.1 64 bit ISO - это установочный образ для Kali.
Чтобы было понятно, версия Virtual Box - это файл, который вы открываете с помощью Virtual Box, а версия ISO - это файл, который вы записываете на DVD или dd
на USB-носитель, чтобы вы могли установить операционную систему на машину.
Так что ответ НЕТ: вам не нужно использовать ISO для создания виртуальной машины Kali, если у вас уже есть пакет Virtual Box.